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血泪教训!Western blot 最全避雷手册汇总出炉!收

发布时间:2022-06-04 05:25:24 来源:艾尚体育网页 作者:艾尚体育首页    

  原标题:血泪教训!Western blot 最全避雷手册汇总出炉!收藏版

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  答: 灵敏,可达ng级,用ECL显色法可达pg级。灵敏,相对便宜且特异性高。

  答:a)有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全,可以适当提高SDS的浓度,同时将样品煮沸时间延长,一般需96℃以上10-15min左右;

  答:减少抗原上样量,降低一抗浓度,改变一抗孵育时间和温度(尽量4℃过夜,此孵育条件比37℃1h要温和很多),并提高封闭液浓度。

  答:你的一抗浓度较高,二抗上HRP催化活力太强,同时你的显色底物处于一个临界点,反应时间不长,将周围底物催化完,形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低,或更换新进口的显色底物。

  b) ECM底物中本身含双氧水,不稳定,见光或温度高时易失活;现配现用。

  答:a) 可能是红灯造成的, 胶片本来就被曝光了,可以在完全黑暗的情况下操作,看是否有改善.;

  答:DAB有毒,但是比较灵敏,是HRP最敏感的底物;ECM结果容易控制,但被催化时灵敏度差一点,但如果达到检测的阀值,就特别灵敏,可以检测pg级抗原。具体选择还是要看你实验的情况,目前大家一般使用ECM。

  答:a)所检测的抗原形成二聚体。增多巯基乙醇量,煮沸变性时间延长,可以打开二聚体。

  答:可能是:a)样品浓度过低;b)转移时间不够。(注意!Marker并不是蛋白是否转移到膜上的标准,它只是为我们提供简单的指示作用。)

  答:NaF是一种广谱磷酸化酶的抑制剂,一般最好加。但是不加也可以,大部分时候是不用加的。建议可多种抑制剂混合使用。

  14、要验证某个细胞上有无该蛋白的存在,需要做免疫组化和WB试验吗?做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗?

  答:a)免疫组化可以用来进行定位,但是不能精确定量,而且有时会有假阳性,不易与背景区分;WB可以特异性检测某个蛋白质分子,如抗体选择合适,灵敏度很高。WB进行定量,但是不能定位。

  b)两种实验的一抗有时候不能通用,公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验,在免疫组化时,是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

  15、做WB时,提取蛋白后冻存(未加蛋白酶抑制剂),用了一抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到120μg,换了一种一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗?

  b)样品未加蛋白酶抑制剂。同时,建议检查WB过程,提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说,一般加PMSF就可以了,最好能多加几中种蛋白酶抑制剂(PMSF在水溶液中不稳定,30min就会降解一半,必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF,样品处理超过1小时,补加1次。见水易分解,使用前加入)。

  答:当然可以,有的甚至可以同时测几十种样品;有时如果抗体特异性高且效价高,同时使用2种一抗,可在一张膜上检测2种不同蛋白。

  答:如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂要温和得多,这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性;部分膜蛋白不好提取,尤其是亚细胞器的膜蛋白。可考虑最新的invent柱式提取法,提取效率高,蛋白丢失较少。

  20、我的样品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上,就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在,只是颜色变淡了,有什么办法可以解决?

  答:你可以加大上样量,没有问题,还有转移时你可以减少电流延长时间,加20%甲醇;还有一种办法就是采用最新的WES来检测,灵敏度极高,但价格贵。

  21、想分离的蛋白是分子量200kd的,SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适?积层胶的浓度又该用多少?这么大分子量的蛋白容易作WB吗?

  答:200kd的蛋白不好做,分离胶用7%,积层胶 3.5%。这种分子量蛋白建议加大电泳电转的电场强度和加长作用时间,但必须控制温度,保证低温电泳和电转。

  答:可以浓缩样品,也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载30%是不会有问题的,建议尽量不超载加样。如果已经超了不少了,而且小分子量的也要,可以考虑加大胶的厚度,以增大上样孔体积,可以试1.5mm厚的胶。

  答:-80℃,若没有反复取出冻融,保存一两年没有问题。最关键两条:不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。

  24、我所测定的蛋白分子量是100KD左右,按理说分离胶应当采用7.5%,但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11%的配方,不知为何?

  答:上述提到的两种凝胶均可以使用,因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内,但需注意目的条带位置肯定会发生一定地偏移。

  25、二抗是生物素化的抗体,三抗是亲和素生物素体系,不知采用这样的方案后,封闭液是否要作调整,能否再用5%的脱脂奶粉呢?好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成,是吗?

  答:不能使用脱脂奶粉,因为脱脂奶粉中含较多的生物素,用BSA(5%、8%)代替会好一点。

  答:WB一般上样30-100μg不等,结果跟目的蛋白的表达丰度、上样量、一二抗的量以及孵育时间都有关系,也与显色时间长短有关。开始摸条件时,为了拿到阳性结果,各个步骤都可以量多一点时间长一点,当然背景也就出来了。要拿到好的结果,如果抗体好的话比较容易,抗体不好的话就需要反复地试了。当然有的蛋白不适合WB的怎样做也不行,或者抗体效价低则注定事倍功半。

  答:必须进行研磨、匀浆、超声处理(注意降温),蛋白质溶解度会更好,离心要充分(12000转/min,10-15min)。膜蛋白必须用更剧烈的方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入足量的PSMF)。

  答:做200KD蛋白的WB时要注意,分离胶最好选择7%的;胶很软,剥胶时要小心;转移时间需要相应延长(至少300mA,3h或以上);必须要使用大量程的Marker(否则出现杂带不知如何分析问题)。

  答:上样量要根据实验的要求来定,如果要求是定量和半定量的WB则上样量要均等,如果只是要定性,则没有太大的关系, 尽量多上就行了,但是不要超载。

  答:主要是一抗要选择好。对二抗无要求,要看你实验条件来选择,一般推荐用HRP标记的二抗。

  答:所有的抗体工作溶液一般不主张回收冻存反复使用,但是如抗体比较珍贵,可反复使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用,4度保存,避免反复冻融。

  答:PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

  答:肯定可以,建议先检查非磷酸化蛋白,然后使用抗体洗脱液将抗体洗去,再在该膜上重新孵育磷酸化一抗。

  37、转膜后经丽春红染色的条带,为什么大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好,为什么?

  答:这是正常的,大分子的蛋白转移很慢,你延长转移时间和电流,大分子一端就会好的多,但是小分子的就有可能会变淡(转过的表现)。注意一点:丽春红染色较好,不是你的目标蛋白成功转移至膜上的标准,这是两个概念,;丽春红染色很多时候只是提供一个粗略的参考而已。

  答:这多半是抗体的问题,要看抗体的说明,是否能做WesternBlot和免疫组化。

  答:一抗的稀释度是有说明的,根据你的一抗看看就知道了,但是那么大的膜孵育体积一般最少为3-5ml。建议尽量还是裁剪膜,不要整张膜孵育,费抗体而且可能会孵育不均匀(个人建议,仅供参考)。

  答:无特殊要求。但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液,下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液;小编发现电泳时产热也很厉害,其实可以在电泳时加冰浴。

  答:没有问题,就是你胶里的水分被电泳产热蒸发了。其次配好的胶在过夜时拿保鲜膜包起来,在里面加点电泳液保持湿度就可以了;也可能30%聚丙酰胺有问题,你可以重新配制一份试试或直接买商用的30%聚丙酰胺;能够替换的试剂,尽量换一下,选用进口试剂。

  42、蛋白质的分子量跨度很大,如要分离小21KD,中至66KD,大至170KD,可以一次做好吗?

  答:这么广的分布不好转移,一般建议:21KD和66KD可以一起转,一起做。采用12%SDS-PAGE,湿转120mA,45-60min就可以了,可以根据你实验室师兄师姐的调节;而170KD蛋白用7%SDS-PAGE,至少200mA 120min。

  答:可以考虑:转移缓冲液中加入20%甲醇(是指终浓度),因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率,但可增加蛋白质和NC膜的结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS,也是为了增加转移效率;用优质的转移膜,或使用小孔径的NC膜(0.2μm)。

  44、我用的是可视Marker,但是电泳总跑不全8条带,请问什么原因?怎样改善?胶用过8%,10%,12%,都是这样。Marker是新买的。

  答:一般来说,是小分子量Marker跑走了,增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择,现在已经有商用梯度胶了,大家可自行选择。

  答:可以选用组蛋白,组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的,有很多都可以当成内参,动动手查查就可以选出你要的内参。(也可以私信小编哦)

  答:一般选用β-actin就可以,也可以使用GAPDH,但是如果做能量、代谢这方面的研究还是尽量选择β-actin。

  48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗?受不受组织来源的影响?胞膜和胞浆有区别吗?

  答:一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了,操作时保持冰浴,保持低温。除非有文献特别指明必须使用特殊方法,一般来说没有区别。

  49、转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”,其中TBST的T是Tween吗,浓度是多少?

  50、封闭,一抗,二抗时的温度有没有什么规定呢,比如在室温里做,或者要在4度下?

  答:均可在室温进行,如果时间不够,一抗孵育可以先在室温进行一个小时,然后4度过夜。小编建议尽量还是4℃过夜孵育,原因在上面已说明。

  答:一般而言,硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联,这样的话,反复洗几次后,蛋白容易掉下来,结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合,同时也有疏水作用,但相对较弱。这样的话,PVDF膜和蛋白接合较牢,不易脱落,结果较好。

  52、怎样才能跑出漂亮的胶,泳道都能很直,上样的量和灌胶是否很重要,电压有什么要求?

  a)小电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小,条带越漂亮,浓缩胶55V,分离胶75V就能跑得很好,但是实验的时间会很长。

  b)胶的均匀度,胶越均匀,条带越窄,分离越均匀。倒胶之前,一定要充分混匀(不要有气泡),玻璃板一定要干净,双蒸水隔离时,一定要比较轻地加上去,避免稀释上层的分离胶。

  53、为什么提高大分子量蛋白的转移的时候,小分子量蛋白会丢失一些哪?什么原因?

  答:小分子的蛋白在转移过程中,会透过膜去,所以大分子的上去以后,有一部分小分子的就透过去了。

  原因:凝胶不均匀冷却,中间冷却不好;电泳系统温度偏高,而且电场强度太大(电泳的电场大致呈现U形,所以因为赶时间而加大电压可能会出现这个)。

  原因:可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全。

  ④选择的膜容易产生高背景,一般NC膜的背景会比PVDF膜低,但是NC膜吸附力也就差了一点。

  ⑤膜在整个实验过程中干过或手套反复接触过,实验过程中要注意保持膜的湿润,使用镊子夹取膜。

  ①目的蛋白存在多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点等等),本身可以出现多条带。查文献或生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,去除修蛋白饰后确定蛋白实际大小,这个需要一定的生物化学基础和生信分析能力。

  ③样本处理过程中目的蛋白发生降解,加入蛋白酶抑制剂;样本处理在冰上操作。

  ①你所检测的样本中不表达目的蛋白,选择表达量高的细胞作为阳性对照,用于确定检测样本是否为阴性,同时查阅文献。

  ③转移不完全或过转移,可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流。

  ⑦洗膜过度,洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。

  ①膜上多处出现黑点或黑斑,原因有2点,抗体与封闭试剂发生非特异性的结合;或者配的奶粉没有充分溶解,奶粉团粘在膜上而没洗干净。

  ③蛋白分子量偏低或偏高,原因:胶浓度不适合,高分子量要用低浓度胶;小分子蛋白要用高浓度胶。

  爱护身体,保护自己。安全第一,实验第二。安全无小事!操作有毒试剂时,一要定带手套和口罩,且操作挥发性试剂一定要在通风橱中进行。

  以上为本期内容。简单地为大家提供一些建议,希望大家的实验能顺顺利利,早日完成SCI大业!

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